Влияние водных экстрактов ржи и ячменя на активность кормовых ферментов

• Синицын А.П., доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией химического факультета, МГУ им. М.В. Ломоносова
• Шашков И.А., младший научный сотрудник
• Рубцова Е.А., кандидат химических наук, научный сотрудник
• Короткова О.Г., кандидат химических наук, научный сотрудник, ФИЦ Биотехнологии РАН
• Синицына О.А., кандидат химических наук, старший научный сотрудник химического факультета, МГУ им. М.В. Ломоносова

Аннотация.

В статье в условиях in vitro проанализирована гидролитическая способность ряда отечественных и зарубежных кормовых ферментных препаратов по отношению к некрахмальным  полисахаридам, находящимся в водных экстрактах ржи (ксиланы) и ячменя (бета-глюканы) для уменьшения их вязкости и реализации основной функции кормовых ферментов, предназначенных для разрушения НПС.

Ключевые слова:

• Некрахмальные полисахариды, ферментные препараты, ксиланазы, бета-глюканазы, белковые ингибиторы.
• The Effects of Watery Extracts of Rye and Barley on the Activities of Enzymatic Feed Additives
• Sinitsyn A.P., Dr. of Chem. Sci., Prof., Head of Lab., Chem. Faculty, Moscow State University of M.V. Lomonosov
• Shashkov I.A., Junior Scientist
• Rubtsova E.A., Cand. of Chem. Sci., Scientist
• Korotkova O.C., Cand. of Chem. Sci., Scientist, Federal Research Center «Biotechnologies» of RAS
• Sinitsyna O.A., Cand. of Chem. Sci., Senior Scientist, Chem. Faculty, Moscow State University of M.V. Lomonosov
• Summary.

Authors studied in vitro the activities of different home-made and imported feed-grade enzymes in the hydrolysis of non-starch polysaccharides (NSPs) in watery extracts of rye (containing xylans) and barley (containing beta-glucanes). The efficiency of the preparations in the decrease of the viscosity of the extracts and in the NSP-degrading ability was studied.

В России для кормления моногастричных сельскохозяйственных животных и птицы используют злаковые культуры (пшеницу, рожь, ячмень, овёс). Однако зерно, будучи основным компонентом комбикорма, содержит некрахмальные полисахариды (НПС), затрудняющие процесс переваривания питательных веществ. Компоненты НПС злаков – ксиланы и бета-глюканы – образуют вязкие водные растворы, не перевариваемые в желудочно-кишечном тракте и создающие проблемы для здоровья птицы. НПС сорбируют питательные вещества, которые в неизменном виде выводятся из организма, кроме того, они обладают высокой влагоудерживающей способностью. Это приводит к перерасходу кормов и снижению показателей продуктивности животных. Решить данную проблему можно путём введения в корм ферментных препаратов (ФП), в состав которых входят ксиланазы и бета-глюканазы.

Эффективность действия ферментов, в первую очередь ксиланаз, существенно зависит от степени ингибирования их белковыми ингибиторами, входящими в состав большинства злаков. Ингибиторы оказывают негативное влияние на активность ферментов, за счёт этого реализуется защитный механизм растений от фитопатогенных микроорганизмов. В различных растениях были обнаружены белковые ингибиторы протеаз и карбогидраз (α-амилаз, пектиназ, ксилоглюканаз и т.д.) – ферментов, способных расщеплять полисахариды растений. В конце 1990-х годов в зёрнах пшеницы (Triticum aestivum) были обнаружены различающиеся по структуре и свойствам белковые ингибиторы ксиланаз, названные TAXI-I и II (T.aestivum xylanase inhibitor) и XIP (xylanase inhibiting protein). TAXI- и XIP-подобные ингибиторы были найдены и в других злаках – ячмене, ржи, рисе, кукурузе. Несколько лет назад в пшенице был обнаружен ингибитор третьего типа, который проявляет сходство с семейством растительных белков тауматинов, на этом основании он был назван TLXI (thaumatin-like xylanase inhibitor). Белковые ингибиторы ксиланаз способны специфично воздействовать на грибные и бактериальные ксиланазы, относящиеся к 10- и 11-му семействам гликозил-гидролаз, наиболее часто используемых в составе кормовых ФП, но они не ингибируют эндогенные ферменты, продуцируемые самими растениями.

Одним их важных требований, предъявляемых к кормовым ферментам (в первую очередь - ксиланазам) является низкая степень ингибирования белковыми ингибиторами злаков или его отсутствие. Поэтому создания метода количественного определения степени ингибирования ксиланаз (и другиз ферментов) в условиях in vitro, то есть лабораторным путём, до начала практического применения тех или иных ФП в условиях in vivo (при кормлении животных) является, с нашей точки зрения, весьма актуальным.

Метод определения степени ингибирования in vitro заключается в том, чтобы сравнить степень уменьшения вязкости водного экстракта зерна ржи (или ячменя) под действием ферментов до и после термообработки экстракта.

Рожь выбрана в силу того, что ее водный экстракт обладает вязкостью благодаря наличию в нём водорастворимых ксиланов. Помимо ксиланов экстракт содержит белковые ингибиторы ксиланаз, которые в нативном состоянии оказывают ингибирующее воздействие на ксиланазы. Термическая обработка водного экстракта зерна ржи приводит к денатурации белковых ингибиторов, однако не влияет на ксиланы, в результате вязкость (термо) инактивированного экстракта практически не отличается от вязкости исходного экстракта. При наличии ингибирования ксиланаз уменьшение вязкости нативного (не подвергнутого термической обработке) экстракта зерна ржи будет меньше, чем инактивированного. При отсутствии ингибирования степень уменьшения вязкости экстракта зерна ржи до и после термообработки будет практически одинаковой.

Для ячменя основным водорастворимым полисахаридом является бета-глюкан, поэтому использование его водных экстрактов позволит исследовать влияние бета-глюканазы кормовых ФП и вязкость экстрактов и наличие или отсутствие ингибиторов.

Следует отметить, что информация о максимальной степени уменьшения вязкости нативного экстракта ржи (и ячменя) в результате действия на них ФП указывает, на наш взгляд, на их гидролитическую способность по отношению к водорастворимым НПС – ксиланам и бета-глюканам. Данная характеристика ферментов наряду с информацией о влиянии ингибиторов, может быть использована для сравнения их свойств  и должна учитываться при выборе для использования в качестве кормовых добавок.

Методика определения наличия и степени ингибирования ферментов белковыми ингибиторами зерна злаков подробно уже нами описана. Для приготовления экстрактов рожь или ячмень измельчали до размера частиц 0,5 мм. Экстракцию проводили в течение 1 ч при 40°С, добавляя 6 г моло­того зерна к 30 мл Na-ацетатного буфера (0,1 М, pH 5,0), суспензию перемешивали в шейкере, 140 об/мин. Полученный экстракт центрифугировали в течение 5 мин, 5000 об/мин., супернатант фильтровали через полиэфир­ную ткань для удаления взвешен­ных частиц. Таким образом, был приготовлен нативный экстракт ржи или ячменя, хранение которого осуществлялось в холодильнике. Часть этого экстракта ржи или ячменя выдерживали в кипящей водяной бане в течение 5 минут. После термической обработки его центрифугировали в течение 5 мин, 5000 об/мин, полученный супернатант представлял собой инактивированный экстракт ржи или ячменя (его также хранили в холодильнике).

Исследования влияния ФП на вязкость водных экстрактов ржи или ячменя осуществляли с помощью помещённого в водную баню капиллярного вискозиметра Оствальда ВПЖ-4 (диаметр капилляра 0,62 мм) по следующей методике. К 4 мл экстракта в вискозиметре добавляли 1 мл Na-ацетатного буфера (0,1 М, pH 5,0), раствор перемешивали и инкубировали при 40°С в течение 5 минут. Далее добавляли аликвоту раствора ФП (50 мкл) в 0,1 М Na-ацетатном буфере, pH 5,0, разбавленного так, чтобы в реакционной смеси содержалась в сумме 1 ед. ксиланазной (в случае экстракта ржи) или 1 ед. бета-глюканазной (в случае экстракта ячменя) активности, и через определённые промежутки времени измеряли время истечения экстракта из вискозиметра (при 40°С). Начало реакции отсчитывали от момента добавления к экстракту раствора ФП. Результаты представляли в виде уменьшения приведённой вязкости разбавленного экстракта после 20 минут ферментативной реакции:

Уменьшение ƞ_пр(э) =

(1 -ƞ_пр(э)/ ƞ_пр°(э)) • 100%,

где ƞ_пр(э)/ ƞ_пр⁰(э) — отношение приведённой вязкости экстракта после добавления ФП к приве­дённой вязкости исходного экс­тракта. Время ферментативной ре­акции рассчитывали как сумму времени, прошедшего до начала его измерения истечения раство­ра и половины измеренного вре­мени истечения.

Время истечения ацетатного буфера составляло ̴ 65 секунд, время истечения разбавленных нативного и инактивированного экстрактов ржи ̴ 330 и  ̴ 340 секунд, время истечения нативного и инактивированного экстрактов ячменя ̴ 79 и ̴ 77 секунд.

Недавно мы проанализировали состав и свойства широкого круга отечественных и зарубежных ФП, используемых в качестве добавок к кормам сельскохозяйственных животных и птицы и определили содержание в них основных ферментов – эндоглюканаз (бета-глюканаз), целлобиогидролаз и ксиланаз, приводящих к деструкции НПС (табл. 1). На основании данных по компонентному составу и уровню различных видов активности мы предложили разделить исследованные ФП на три группы: а) с высоким содержанием ксиланаз и низким – целлюлаз (эндоглюконаз и целлобиогидролаз), б) с высоким содержанием целлюлаз и низким – ксиланаз, в) содержащие в разном соотношении эндоглюканазы, целлобиогидролазыи ксиланазы, однако без существенного преобладания содержания какого-либо из этих ферментов (отметим, что данные по активности исследованных ФП были приведены нами в публикациях журнала «Птицеводство» №5, 2016; №4, 2018).

В настоящей работе мы проанализироваали наличие и степень ингибирования ксиланазной активности, а также уровеь уменьшения вязкости для ФП, относящихся к группам а) и в). В качестве критерия эффективности деструкции водорастворимых ксиланов ржи мы выбрали степень уменьшения вязкости нативного и инактивированного экстракта ржи (для этого сравнивали вязкость экстракта в начальный момент времени и через 20 минут после внесения в экстракт раствора ФП). Эксперименты по исследованию влияния ФП на вязкость водных экстрактов ржи проводили при одинаковой дозировке ФП по ксиланазной активности в реакционной смеси.

Наиболее эффективно (примерно на 60%) снижали вязкость нативного и инактивированного экстрактов ржи ксиланазы ФП Эконаза ХТ 25, Агроксил Плюс, Агроксил Премиум, Ровабио Макс АР и Санзайм. Характерно, что ксиланазы именно этих ферментов не ингибировали белковыми ингибиторами ржи – для них практически не наблюдалось различия в степени уменьшения приведённой вязкости нативного и инактивированного экстрактов ржи (табл. 2). Ксиланаза ферментного препарата Эндофид также не ингибировалась белковыми ингибиторами ржи, однако этот препарат приводил к менее существенному уменьшению приведённой вязкости (на 44-48%), чем указанные выше препараты. Ксиланазы препаратов Акстра ХАР 101, Акстра ХВ 201, Роксазим G2G, Агроксил, Агроцелл, Ксибетен-Ксил и Вилзим ингибировались белковыми ингибиторами ржи, поскольку под действием этих ФП приведённая вязкость нативного экстракта ржи снижалась существенно меньше (лишь на 21-28%) по сравнению с инактивированным экстрактом (44-60%).

В таблице 3 представлены данные, характеризующие уменьшение приведённой вязкости водного экстракта ячменя под действием исследуемых ФП (эксперименты по исследованию влияния ферментов на вязкость водных экстрактов ячменя проводили при одинаковой из дозировке по бета-глюканазной активности). Отметим, что из рассмотрения в данном разделе исключён препарат Акстра ХАР 101, не имеющий в своём составе эндоглюканазы и не обладающий бета-глюканазной активностью.

Наиболее эффективно снижали вязкость водорастворимых бета-глюканов ячменя Визим, Ровабио Макс АР, Агроксил, Агроцелл и Акстра ХВ 201 (произведённая вязкость снижалась примерно на 80-95%). Другие ФП менее эффективно влияли на вязкость водного экстракта ячменя. Отметим, что для всех исследуемых ферментов (за исключением Ксибетен-Ксил) снижение приведённой вязкости нативного экстракта ячменя было практически таким же, как и инактивированного, что свидетельствует об отсутствии ингибирования белковыми ингибиторами ячменя бета-глюканаз.

Таким образом, в настоящей работе мы проанализировали в условиях in vitro гидролитическую способность ряда отечественных и зарубежных кормовых ФП по отношению к НПС, находящихся в водных экстрактах ржи (ксиланы) и ячменя (бета-глюканы), для уменьшения их вязкости, то есть реализации основной функции кормовых ферментов, предназначенных для разрушения НПС. Кроме того, была исследована степень влияния на активность ФП ингибиторов, находящихся в водных экстрактах злаков и для ряда ферментов показано наличие ингибирования ксиланаз белковыми ингибиторами экстрактов ржи, тогда как наличия ингибирования бета-глюказной активности водными экстрактами ячменя обнаружено не было.

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России, ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (идентификационный номер ПНИЭР RFMEFI60716X0159), а также с использованием научного оборудования ЦКП «Промышленные биотехнологии» ФИЦ Биотехнологии РАН.

Литература:

1. Чернышев Н.И., Панин И.Г., Шумский Н.И., Гречишников В.В. // Антипитательные факторы кормов. Воронеж. 2013. 206 с.
2. Бутейкис Г., Блажинскас Д. Ферменты – гарантия ощутимой выгоды сегодня и в будущем // Комбикорма. 2012. №6. С.105.
3. Choact М. Non starch polysaccharides effect on nutritive value / McNab J.M., Bo­orman K.N. // Poultry Feedstuffs Supply, Composition and Nutritive Value. Trowb­ridge. 2002. P. 221.
4. Aehle W. // Enzymes in Industry: Pro­duction and Applications. Weinheim. 2007. P. 209.
5. Гусаков А.В. Белковые ингибиторы ксиланаз. Обзор. Биохимия. 2010. Т. 75, №10. С. 1331-1347.
6. Синицын А.П., Зоров И.Н., Короткова О.Г., Мерзлов Д.А., Метод определения степени ингибирования ксиланаз белковыми ингибиторами злаков // Птицеводство. 2016, №1. С. 19-24.
7. Короткова О.Г., Рубцова Е.А., Шашков И.А., Волчок А.А., Кондратьева Е.Г., Синицына О.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Денисенко Ю.А., Семёнова М.В., Синицын А.П. Сравнительный анализ состава и свойств кормовых ферментных препаратов // Катализ в промышленности. 2018. Т. 18. №4. С. 72-78.
8. Короткова О.Г., Синицына О.А., Кержнер М.А., Мосеев П.А., Синицын А.П. Активность ферментов, предназначенных для деструкции некрахмальных полисахаридов // Птицеводство. 2016. № 5. С. 8-13.
9. Волчок А.А., Короткова О.Г., Крюков В.С., Синицына О.А., Синицын А.П., Шашков И.А. Активность ксиланаз и глюканаз кормовых ферментных препаратов в ЖКТ птицы // Птицеводство. 2018. №4. С. 39-45.